mRNA疫苗
mRNA疫苗打破了傳統滅活、減毒疫苗的免疫激活模式，創新性地利用人體本身細胞生產抗原，以此激活特異性免疫。mRNA疫苗的保護率極高，能達到90%。在研發上，mRNA疫苗能夠快速地更新迭代以應對不斷出現的變異毒株，且生產過程短，只需要60-70天。對于新型冠狀病毒疫苗的研制，除了抗原設計外，選擇合適的載體也是至關重要的。在疫情影響下，mRNA 疫苗讓科研人員愈發重視，關于它的各項研究正在如火如荼地進行中。
爭分奪秒|賽默飛全流程助力mRNA COVID-19疫苗研發
核酸疫苗-mRNA關鍵質量屬性CQA
通過工藝開發和質量控制對產品進行描述：為了使疫苗能被監管機構接受，需要對純度/雜質監測(CQAs)進行深入的分析表征和確定的標準，以確保安全性和有效性。這意味著雜質需要通過表征來理解，定義可接受的水平，然后監測安全性和有效性。
行業領先的mRNA解決方案-加速賦能實現企業關鍵性進展
課程一：理想中的二維液相色譜系統——疫苗研究的創新
課程一：理想中的二維液相色譜系統——疫苗研究的創新
Alexander Schwenger 是德國 CureVac AG 的 EPD物理化學經理。 他在斯圖加特大學獲得博士學位。
課程二：液相色譜新技術在核酸疫苗研發中的應用-提純
課程二：液相色譜新技術在核酸疫苗研發中的應用-提純
課程三：液質聯用平臺在 mRNA 疫苗表征及質控中的應用
課程三：液質聯用平臺在 mRNA 疫苗表征及質控中的應用
課程四：使用自動LC-MS工作流程表征mRNA治療藥物
課程四：使用自動LC-MS工作流程表征mRNA治療藥物
課程五：Automated workflow for mRNA sequencing by high resolution LCMS
課程五：Automated workflow for mRNA sequencing by high resolution LCMS
課程六：液相色譜耗材技術在基因治療和預防藥物中的表征
課程六：液相色譜耗材技術在基因治療和預防藥物中的表征
只需30秒簡單注冊，即可解鎖上述所有mRNA課程。
目前獲批上市的疫苗佐劑多數集中在微小顆?；蚣{米顆粒，包括鋁鹽、乳劑、脂質體和病毒載體。
脂質體主要由磷酸類脂、膽固醇、硬脂胺等組成的單層或多層雙分子夾水結構，可包裹多種疫苗，并有效地將抗原送至細胞對應靶點。其作用機制與鋁佐劑相似，具有儲存庫效應，并可以增強抗原遞呈細胞（APC）對抗原的攝入。
由上述介紹可以看出，大部分佐劑都沒有紫外吸收，CAD電霧式檢測器較傳統紫外檢測器、ELSD檢測器等有著獨特的優勢，分析物既不需要發色團也不需要離子化，適用于不揮發及半揮發化合物的高靈敏度檢測。
CAD檢測器有更高的靈敏度、更寬的線性范圍、更好的重現性成為新冠mRNA疫苗質量控制的首選。本實驗利用Vanquish Flex液相色譜系統和Charged Aerosol Detector H電霧式檢測器來分析疫苗中的佐劑。
色譜圖：
系統適用性色譜圖
實驗結果與討論:
PEG(聚乙二醇)、Chol(膽固醇)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)以及兩種自制佐劑在0.25 μg/ml～50 μg/ml范圍內線性良好，相關系數R2 >0.999。 本方法五種組分檢測限為0.125 ppm(S/N=3)，定量限為0.25 ppm(S/N=10)。
定量限色譜圖
由實驗結果可知，本方法利用CAD電霧式檢測器直接檢測疫苗中的脂質體載體，無需進行前處理，靈敏度高，分離度和重復性好。
樣品前處理簡單，樣品經純化水稀釋后可直接進樣分析。
制劑樣品色譜圖
新冠疫苗主流研發工藝
1. 前處理
Nuclease T1是一種真菌核酸內切酶，可切割鳥嘌呤殘基后的單鏈RNA，具有較強的特異性，常用于核酸測序應用。但由于核酸內切酶效率很高，酶解時間較難控制，且傳統的溶液酶解方法會使核酸酶殘留在分析柱上造成污染?；谝陨闲枨螅惸w推出了一款前處理磁珠，將Nuclease T1酶固定在磁珠上，通過簡單快速的磁鐵吸附及可有效控制酶解時間，并去除溶液里的T1酶，該方式可以有效提高實驗的重現性并降低酶的干擾（如下圖）。
有離線及在線兩種方式可供選擇：a) 將樣品配成200 μL體積放于eppendorf管中（如下圖a所示），置于酶解儀中震蕩孵育（37-50℃, 2000 rmp）5min ，通過磁鐵吸附的方式將酶解上清與磁珠分離，再加入1%甲酸終止反應；b) 采用全自動磁珠純化儀，反應、分離及純化均可根據設置好的程序進行自動操作，適用于高通量前處理需求（圖b）。
圖a:手動前處理示意圖
圖b: 全自動化在線前處理示意圖
反應條件的優化：
a. 反應時間：酶解時間控制在5min 內，隨著反應時間的增加（30min, 1h, 4h, overnight），序列覆蓋度明顯降低。對于修飾mRNA（如甲基化修飾），需要增加反應時間至30min.
b. 反應溫度：37℃與50℃的結果類似
2. 色譜柱
色譜分離采用一款專用于核酸分析的色譜柱，Thermo Scientific? DNAPac? RP，該色譜柱由球形寬孔徑 4 μm 聚合樹脂構成，可耐受極端 pH (0-14) 和溫度 (5-110°C) 條件，在HPLC 和UHPLC儀器上均可使用，針對寡核苷酸可實現高分辨率和高通量，較小和極大的核酸鏈均可分辨(如下圖A)。圖B顯示DNAPac? RP色譜柱的各類型號，mRNA mapping建議選用2.1*100 mm型號。
圖 A
圖 B
3. 液相系統
核酸樣品吸附性強，而生物惰性液相系統吸附低；其次離子對試劑易腐蝕液相系統管路及接口，因此建議使用生物兼容的Vanquish UHPLC系統。
液相方法如下圖：
4. 質譜
新一代Orbitrap Exploris系列產品具有體積小、性能高、操作簡單等優勢，擴展了Q Exactive系列質譜儀器的分析能力。如下圖a所示，內置的AcquireX數據采集工作流程，為各種不同類型的應用設置參數模板，一鍵調用，可進行全面自動化的樣品分析；且帶有EASY IC離子源內標校正，保證儀器的高質量精度；更快的掃描模式可提高樣品分析通量。圖b顯示mRNA mapping的方法模板：在peptide mode模式下，一級采用120，000分辨率，二級30，000分辨率；負離子掃描模式；stepped NCE 25,28,31 (優化后的能量，適用于mRNA mapping). 該方法模板可一鍵調用，操作簡便，且得到高質量的譜圖。
5. 數據分析軟件
Biopharma Finder軟件可實現核酸樣品自動化數據分析，如下圖a所示，軟件支持DNA及RNA樣品序列管理，可自定義核酸骨架和可變修飾，操作簡便；對二級譜圖進行自動化注釋和解析；寡核苷酸雜質定性和相對定量分析；多批次樣品含量變化趨勢比對。圖b 展示定結果圖表，列表里的每一行代表一條鑒定的核酸鏈，右上方對應的理論及實測二級圖譜，將圖譜里響應很低的峰放大，可以清楚的看到碎片離子的同位素峰，結果可信度高。
圖 a
圖 b
Biopharma Finder 4.1版本在寡核苷酸分析的基礎上增加了長鏈mRNA mapping的功能，在數據處理方法中增加核酸酶模塊，有常見的幾種酶供選擇，也可自定義添加酶。下圖展示mapping分析結果，對于mRNA樣品中每一條確證序列的片段，均可溯源詳細信息，如在序列中的位置、一級和二級譜圖、可信度、定量信息等。對于長度3900nt的mRNA樣品，在該分析流程下，僅用RNAse T1酶解，即可獲得98.5%序列覆蓋度結果。
得益于Orbitrap儀器采集的高質量圖譜，在核酸分析結果里幾乎每一條鏈都可實現100%序列覆蓋（Average Structural Resolution=1.0），這對于區分同分異構體非常有幫助。前面我們提到mRNA由4個特定堿基構成，在其酶解片段中出現同分異構是常見的現象，如下圖，當儀器檢測到足夠多的碎片離子，可以確證同分異構的兩條鏈里的每一個堿基，即可輕松區分兩條分子量相同，序列不同的片段。
對于長鏈RNA片段，如下圖具有13個漏切位點，48個堿基長度的片段，也可鑒定到每一個堿基，得到高可信度結果。酶解片段越長，其序列特異性越強，對于RNaes T1酶解無法覆蓋的短片段，也可采用mazF酶解得到的更長片段作為互補信息。
案例分享：
編碼新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)樣品分析，首先用反相離子對色譜檢測mRNA樣品純度，如下圖a所示。采用上述mRNA mapping分析平臺，從前處理到液質表征分析，得到如下結果：圖b顯示mRNA樣品經過RNase T1酶解后的總離子流圖，由于部分酶解，得到的片段較長，具有高特異性；與理論堿基序列匹配，在嚴格的數據篩選條件下，可得到98.5%的序列覆蓋度。
圖 a
圖 b: Spike Protein mRNA digested with T1
圖 c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA
基于Orbitrap高分辨質譜核酸分析平臺，可以實現mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、雜質鑒定及定量等功能，為疫苗開發和質控提供更精確可靠的數據。
參考文獻：
[1] Jackson, N. et al. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Vaccines 11, (2020)
[2] Jiang, T. et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Anal. Chem. 91, 8500?8506 (2019)
相關產品
課程一：理想中的二維液相色譜系統——疫苗研究的創新
課程一：理想中的二維液相色譜系統——疫苗研究的創新
課程二：液相色譜新技術在核酸疫苗研發中的應用-提純
課程二：液相色譜新技術在核酸疫苗研發中的應用-提純
課程三：液質聯用平臺在 mRNA 疫苗表征及質控中的應用
課程三：液質聯用平臺在 mRNA 疫苗表征及質控中的應用
課程四：使用自動LC-MS工作流程表征mRNA治療藥物
課程四：使用自動LC-MS工作流程表征mRNA治療藥物
課程五：Automated workflow for mRNA sequencing by high resolution LCMS
課程五：Automated workflow for mRNA sequencing by high resolution LCMS
課程六：液相色譜耗材技術在基因治療和預防藥物中的表征
課程六：液相色譜耗材技術在基因治療和預防藥物中的表征
只需30秒簡單注冊，即可解鎖上述所有mRNA課程。
目前獲批上市的疫苗佐劑多數集中在微小顆?；蚣{米顆粒，包括鋁鹽、乳劑、脂質體和病毒載體。
脂質體主要由磷酸類脂、膽固醇、硬脂胺等組成的單層或多層雙分子夾水結構，可包裹多種疫苗，并有效地將抗原送至細胞對應靶點。其作用機制與鋁佐劑相似，具有儲存庫效應，并可以增強抗原遞呈細胞（APC）對抗原的攝入。
由上述介紹可以看出，大部分佐劑都沒有紫外吸收，CAD電霧式檢測器較傳統紫外檢測器、ELSD檢測器等有著獨特的優勢，分析物既不需要發色團也不需要離子化，適用于不揮發及半揮發化合物的高靈敏度檢測。
CAD檢測器有更高的靈敏度、更寬的線性范圍、更好的重現性成為新冠mRNA疫苗質量控制的首選。本實驗利用Vanquish Flex液相色譜系統和Charged Aerosol Detector H電霧式檢測器來分析疫苗中的佐劑。
色譜圖：
系統適用性色譜圖
實驗結果與討論:
PEG(聚乙二醇)、Chol(膽固醇)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)以及兩種自制佐劑在0.25 μg/ml～50 μg/ml范圍內線性良好，相關系數R2 >0.999。 本方法五種組分檢測限為0.125 ppm(S/N=3)，定量限為0.25 ppm(S/N=10)。
定量限色譜圖
由實驗結果可知，本方法利用CAD電霧式檢測器直接檢測疫苗中的脂質體載體，無需進行前處理，靈敏度高，分離度和重復性好。
樣品前處理簡單，樣品經純化水稀釋后可直接進樣分析。
制劑樣品色譜圖
新冠疫苗主流研發工藝
1. 前處理
Nuclease T1是一種真菌核酸內切酶，可切割鳥嘌呤殘基后的單鏈RNA，具有較強的特異性，常用于核酸測序應用。但由于核酸內切酶效率很高，酶解時間較難控制，且傳統的溶液酶解方法會使核酸酶殘留在分析柱上造成污染?；谝陨闲枨?，賽默飛推出了一款前處理磁珠，將Nuclease T1酶固定在磁珠上，通過簡單快速的磁鐵吸附及可有效控制酶解時間，并去除溶液里的T1酶，該方式可以有效提高實驗的重現性并降低酶的干擾（如下圖）。
有離線及在線兩種方式可供選擇：a) 將樣品配成200 μL體積放于eppendorf管中（如下圖a所示），置于酶解儀中震蕩孵育（37-50℃, 2000 rmp）5min ，通過磁鐵吸附的方式將酶解上清與磁珠分離，再加入1%甲酸終止反應；b) 采用全自動磁珠純化儀，反應、分離及純化均可根據設置好的程序進行自動操作，適用于高通量前處理需求（圖b）。
圖a:手動前處理示意圖
圖b: 全自動化在線前處理示意圖
反應條件的優化：
a. 反應時間：酶解時間控制在5min 內，隨著反應時間的增加（30min, 1h, 4h, overnight），序列覆蓋度明顯降低。對于修飾mRNA（如甲基化修飾），需要增加反應時間至30min.
b. 反應溫度：37℃與50℃的結果類似
2. 色譜柱
色譜分離采用一款專用于核酸分析的色譜柱，Thermo Scientific? DNAPac? RP，該色譜柱由球形寬孔徑 4 μm 聚合樹脂構成，可耐受極端 pH (0-14) 和溫度 (5-110°C) 條件，在HPLC 和UHPLC儀器上均可使用，針對寡核苷酸可實現高分辨率和高通量，較小和極大的核酸鏈均可分辨(如下圖A)。圖B顯示DNAPac? RP色譜柱的各類型號，mRNA mapping建議選用2.1*100 mm型號。
圖 A
圖 B
3. 液相系統
核酸樣品吸附性強，而生物惰性液相系統吸附低；其次離子對試劑易腐蝕液相系統管路及接口，因此建議使用生物兼容的Vanquish UHPLC系統。
液相方法如下圖：
4. 質譜
新一代Orbitrap Exploris系列產品具有體積小、性能高、操作簡單等優勢，擴展了Q Exactive系列質譜儀器的分析能力。如下圖a所示，內置的AcquireX數據采集工作流程，為各種不同類型的應用設置參數模板，一鍵調用，可進行全面自動化的樣品分析；且帶有EASY IC離子源內標校正，保證儀器的高質量精度；更快的掃描模式可提高樣品分析通量。圖b顯示mRNA mapping的方法模板：在peptide mode模式下，一級采用120，000分辨率，二級30，000分辨率；負離子掃描模式；stepped NCE 25,28,31 (優化后的能量，適用于mRNA mapping). 該方法模板可一鍵調用，操作簡便，且得到高質量的譜圖。
5. 數據分析軟件
Biopharma Finder軟件可實現核酸樣品自動化數據分析，如下圖a所示，軟件支持DNA及RNA樣品序列管理，可自定義核酸骨架和可變修飾，操作簡便；對二級譜圖進行自動化注釋和解析；寡核苷酸雜質定性和相對定量分析；多批次樣品含量變化趨勢比對。圖b 展示定結果圖表，列表里的每一行代表一條鑒定的核酸鏈，右上方對應的理論及實測二級圖譜，將圖譜里響應很低的峰放大，可以清楚的看到碎片離子的同位素峰，結果可信度高。
圖 a
圖 b
Biopharma Finder 4.1版本在寡核苷酸分析的基礎上增加了長鏈mRNA mapping的功能，在數據處理方法中增加核酸酶模塊，有常見的幾種酶供選擇，也可自定義添加酶。下圖展示mapping分析結果，對于mRNA樣品中每一條確證序列的片段，均可溯源詳細信息，如在序列中的位置、一級和二級譜圖、可信度、定量信息等。對于長度3900nt的mRNA樣品，在該分析流程下，僅用RNAse T1酶解，即可獲得98.5%序列覆蓋度結果。
得益于Orbitrap儀器采集的高質量圖譜，在核酸分析結果里幾乎每一條鏈都可實現100%序列覆蓋（Average Structural Resolution=1.0），這對于區分同分異構體非常有幫助。前面我們提到mRNA由4個特定堿基構成，在其酶解片段中出現同分異構是常見的現象，如下圖，當儀器檢測到足夠多的碎片離子，可以確證同分異構的兩條鏈里的每一個堿基，即可輕松區分兩條分子量相同，序列不同的片段。
對于長鏈RNA片段，如下圖具有13個漏切位點，48個堿基長度的片段，也可鑒定到每一個堿基，得到高可信度結果。酶解片段越長，其序列特異性越強，對于RNaes T1酶解無法覆蓋的短片段，也可采用mazF酶解得到的更長片段作為互補信息。
案例分享：
編碼新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)樣品分析，首先用反相離子對色譜檢測mRNA樣品純度，如下圖a所示。采用上述mRNA mapping分析平臺，從前處理到液質表征分析，得到如下結果：圖b顯示mRNA樣品經過RNase T1酶解后的總離子流圖，由于部分酶解，得到的片段較長，具有高特異性；與理論堿基序列匹配，在嚴格的數據篩選條件下，可得到98.5%的序列覆蓋度。
圖 a
圖 b: Spike Protein mRNA digested with T1
圖 c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA
基于Orbitrap高分辨質譜核酸分析平臺，可以實現mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、雜質鑒定及定量等功能，為疫苗開發和質控提供更精確可靠的數據。
參考文獻：
[1] Jackson, N. et al. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Vaccines 11, (2020)
[2] Jiang, T. et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Anal. Chem. 91, 8500?8506 (2019)